Penentuan Kadar Protein Metode Bradford

Posted by SEKAR ARUMSARI on June 18, 2010 in Academic |

Pendahuluan

Pendahuluan

Manusia memerlukan energi untuk melakukan kegiatan dan aktivitas seharihari, energi tersebut dapat diperoleh dari berbagai bahan makanan. Secara umum, bahan makanan tersebut mengandung karbohidrat, protein, dan lemak. Protein merupakan biopolymer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolymer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur. (Hawab, 2004).

Protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik. Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan protein transport. (Fessenden, 1986)

Ada berbagai cara dalam penentuan kadar protein. Refraktori (menyelupkan refraktomer menurut Pulrich) dengan standar kadar protein ∆n = 0,002/ 1% protein, sangat cepat pelaksanaannya dan hanya memerlukan sedikit bahan, namun tidak spesifik jadi hanya baik untuk pengenalan protein. Uji biuret, metode ini untuk penentuan konsentrasi dengan cara meneteskan protein ke dalam larutan CuSO4 dari berbagai macam konsentrasi. Penentuan kekeruhan dengan Nephelometer yaitu penentuan intensitas kekeruhan dengan memberikan standar sulfosalsilat pada larutan protein, namun metode ini jarang digunakan.  Fotometri (reaksi warna), yaitu dengan meneteskan biuret atau fenol ke dalm larutan protein, reaksi warna akan menjadi biru dari reagenisa biuret dan reduksi asam heteropoli. Penyisaan basah menurut Kjeldahl merupakan metode analitik klasik sehingga perlu persiapan lama dan N dari non protein ikut dalam perhitungan. Selain itu, penentuan kadar protein yang menggunakan dengan metode Lowry akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Dalam percobaan kali ini akan digunakan metode Bradford yang menggunakan suatu pereaksi pewarna yang mampu mengikat protein di dalam sampel. Pereaksi yang digunakan dalam metode Bradford adalah Coomassie Brilliant Blue G-250. Konsentrasi protein diukur berdasarkan optikal density pada panjang gelombang 600 nm. Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, terlebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical dencity (OD). (Kusnawidjaja, 2007)

Tujuan

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein suatu sampel hayati dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu tabung reaksi, dan pipet Mohr, dan tabung Erlenmeyer. Spektrofotometer UV-Vis yang digunakan yaitu spectronic J20 dan kuvet.

Campuran dari larutan BSA, reagen Bardford, dan larutan NaCl merupakan bahan utama yang digunakan pada percobaan untuk menentukan kadar protein. Selain itu, larutan akuades juga digunakan untuk membantu pada proses pembacaan absorban di spektrofometer.

Prosedur Percobaan

Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Pembuatan kurva standar diawali dengan mempersiapkan enam buah tabung reaksi. Pada tabung pertama, diisi dengan 100 µl NaCl. Tabung kedua diisi 90 µl NaCl dan 10 µl larutan BSA. Tabung ketiga diisi dengan 80 µl NaCl dan 20 µl larutan BSA. Tabung keempat diisi dengan 70 µl NaCl dan 30 µl larutan BSA. Tabung kelima diisi dengan 50 µl NaCl dan 50 µl larutan BSA, serta tabung terakhir diisi dengan 100 µl larutan BSA. Keenam tabung tersebut ditambahkan dengan reagen Bradford sebanyak 5 ml. Selanjutnya tabung reaksi tersebut didiamkan selama 5 menit pada suhu ruangan agar campuran tersebut homogen. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 595 nm. Tabung pertama digunakan sebagai blanko dan tidak dimasukkan dalam penentuan kurva standar.

Sebanyak 100 µl larutan sampel dimasukkan dalam tabung reaksi yang bersih. Kemudian ditambahkan dengan reagen Bradford sebanyak 5 ml, dikocok dan didiamkan selama 5 menit. isi tabung tersebut diukur absorbansinya dengan panjang gelombang yang sama. Konsentrasi protein dihitung dengan menarik garis absorbansi rata-rata pada kurva standar yang telah dibuat.

Hasil Percobaan

Tabel 1 Data kurva standarisasi BSA

Konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi
Blanko 0.535
0.1 0.690
0.2 0.794
0.3 0.863
0.5 1.051
1.0 1.284

Contoh perhitungan:

MBSA = M1 = 1 mg/ml

VBSA = V1 = 0.01 ml; V2 = 0.1 ml

V1 . M2 = V2 . M2

0.01 ml . 1 mg/ml = 0.1 ml . M2

M2 = 0.1 mg/ml

Tabel 2 Data konsentrasi sampel

Ulangan A Konsentrasi (mg/ml)
1 0.712 0.071
2 0.884 0.318
3 0.815 0.219
Rataan 0.804 0.203

Persamaan garis linier yang diperoleh:

y = 0.694x + 0.663

r2 = 0.971

r  =

= 0.985

= 98.5%

Keterangan: y = absorbansi, x = konsentrasi larutan

Diketahui absorbansi sampel

0.712   = 0.694x + 0.663

0.694x = 0.712 – 0.663

x =

= 0.071 mg/ml

Jadi, konsentrasi protein dalam sampel 0.071 mg/ml.

Pembahasan

Metode Bradford menekankan bahwa absorbsi spektrum dilakukan dalam dua bentuk pengujian secara bersamaan. Hal ini menyebakan respon yang tidak linear pada kurva standar. Banyak pengguna metode Bradford dan peneliti menganggap bahwa respon yang dihasilkan adalah linear. Meskipun demikian, saat kurva standar digambarkan akan lebih mirip dengan kurva linier. Metode ini hanya akan linier jika konsentrasi larutan standar maupun sampel yang digunakan kecil. (Rosenberg, 2004)

Reagen Bradford yang digunakan pada percobaan ini dibuat dengan cara melarutkan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml 85% (w / v) asam fosfat. Kemudian diencerkan sampai 1 L dengan akuades. Reagen harus disaring melalui Whatman no. 1 filter kertas dan kemudian disimpan dalam botol kuning pada suhu kamar. Reagen yang disimpan harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan. (Rosenberg, 2004)

Dari hasil penelitian Bradford (1976), pereaksi pewarna yang digunakan dalam percobaan ini adalah Coomassie Brilliant Blue G-250. Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) akan mengikat asam amino spesifik yang terdapat pada bagian permukaan protein. Molekul pewarna ini memiliki 6 gugus fenil dan 2 gugus sulfonat yang menyebabkan interaksi yang nonkovalen dan lemah terhadap asam amino hidrofob dan asam amino elektrostatik. CBBG mengikat asam amino dalam bentuk anionik dengan absoransi maksimal pada 595 nm. Pewarna bebasnya (tidak mengikat molekul lain) berada dalam bentuk kationik yang memiliki absorbansi maksimal 465 nm. Oleh karena itu, perlu ditentukan larutan standar protein, panjang gelombang yang digunakan adalah pada saat CBBG berbentuk anionik yaitu sebesar 595 nm.

Metode umum untuk menyiapkan sebuah kurva standar mempersiapkan protein dengan berbagai konsentrasi. Volume sampel standar adalah akhir konsentrasi yang tidak diketahui secara langsung dan dihitung dari garis kuadrat-terkecil dari kurva standar. Sebuah kurva standar pada metode Bradford adalah grafik hubungan absorbansi konsentrasi BSA. Larutan standar BSA dicampur dengan NaCl tidak menimbulkan warna. Namun setelah diberi pewarna maka akan berubah menjadi waena biru kehitaman. Penggunaan NaCl di sini untuk memudahkan BSA agar dapat larut di dalam pewarna serta sebagai katalis agar reaksi cepat berjalan.

Sebelum menggunakan kurva standar, praktikan harus yakin bahwa absorbansi adalah fungsi linear dari konsentrasi larutan, seperti yang disebutkan pada Hukum Beer-Lambert. Hukum Beer yang diterapkan pada metode spektrofotometri ini tidak memiliki konsentrasi tinggi karena menipisnya salah satu reagen yang diperlukan untuk produksi warna. Absorbansi tinggi berarti sedikit cahaya yang dapat tembus melalui sampel. Pembacaan kurva standar selalu harus diambil di wilayah di mana semua reagen melewati batas kurva hubungan absorbansi dan konsentrasi larutan BSA. Persamaan garis yang diperoleh yaitu sebesar y = 0.694x + 0.663 dengan r = 98.5%. Diketahui rataan absorbansi sampel sebesar 0.804, maka konsentrasi protein sampel rata-rata adalah 0.203 µg/µl. Percobaan ini tidak memerlukan pengenceran sampel karena absorbansi sampel masih berada pada rentang ansorbansi larutan standar. Koefisian relasi atau r adalah bilangan yang menujukkan banyaknya titik yang dapat diwakili oleh model regresi linier yang dibut. Koefisien relasi yang bernilai 98.5% berarti keseluruhan titik pada model regresi, 98.5%nya dapat diwakili oleh model tersebut.

Uji Bradford sangat cepat dibandingkan dengan uji Lowry. Hal ini cukup akurat dan sampel dapat diuji ulang dalam beberapa menit. Metode Bradford direkomendasikan untuk penggunaan umum dalam menentukan kadar protein, terutama untuk menentukan kadar protein dari fraksi sel dan menilai konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Akan tetapi, metode Bradford akan membentuk non linier korelasi ketika rentang konsentrasi protein semakin besar. Pewarna yang digunakan akan tertinggal di permukaan kuvet sehingga kurva kalibrasi perlu dilakukan setiap saat.  Tinggi konsentrasi larutan dapat mengganggu proses standarisasi.

Simpulan

Metode Bradford memanfaatkan perekasi pewarna untuk mengetahui kadar protein suatu sampel. Pereaksi pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 akan mengikat protein dan memiliki panjang gelombang maksimal 595 nm. Persamaan garis yang didapat yaitu y = 0.694x + 0.663 dengan r = 98.5%. konsentrasi protein sampel adalah 0.203 µg/µl.

Daftar Pustaka

Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976. [terhubung berkala]

Fessenden. 1986. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta : Bayu Media Publishing.

Kusnawidjaja, K. 2007. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Negeri Yogyakarta: Yograkarta.

Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990). [terhubung berkala]

Rosenberg, I.M. 2004. Protein Analysis and Purification: Benchtop techniques. Massachusetts General Hospital: Boston.

spektrofotometer

Posted by SEKAR ARUMSARI on June 18, 2010 in Academic |

Pendahuluan

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV  (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990).

Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :

a.  Sumber Cahaya

Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 – 2200 nanometer (nm).

b. Monokromator

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu

(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).

c. Cuvet

Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat

contoh atau cuplikan yang akan dianalisis.  Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).

d. Detektor

Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.

Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio  disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T (Underwood 2002).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan praktikan dapat memahami dan mengoperasikan spektrofotometri UV-Vis untuk pengukuran sampel suatu larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu labu takar, tabung reaksi, dan pipet volumtrik. Spektrofotometer UV-Vis yang digunakan yaitu spectronic J20 dan kuvet.

Larutan metilen biru dengan konsentrasi dari 2×10-6 M sampai 1×10-5 M merupakan bahan utama yang digunakan untuk percobaan mengggunakan spektrofotometer UV-Vis. Selain itu, akuades juga digunakan untuk melakukan pengenceran larutan metilen biru menjadi konsentrasi yang berbeda-beda.

Prosedur Percobaan

Sebelum mengukur larutan metilen biru dengan Spectronic 20, hal yang harus dilakukan pertama kali adalah mengencerkan larutan metilen biru 10 mmol dengan konsentrasi 2×10-6 M, 4×10-6 M, 6×10-6 M, 8×10-6 M, dan 1×10-5 M. Larutan metilen biru dengan konsentrasi 6×10-6 M digunakan untuk menentukan panjang gelombang maksimum ( max). Transmitan diukur menggunakan alat spectronic J20 menggunakan panjang gelombang 600-680 nm dengan interval 10 nm.

Untuk membuat kurva standar, transmitan dari tiap konsentrasi larutan metilen biru dibaca menggunakan panjang gelombang maksimum yang kita peroleh, yaitu 660 nm. Hasil pengukuran yang diperoleh dicatat, kemudian dikonversikan menjadi absorban dengan rumus A = -log %T. Setelah itu, dapat dibuat kurva hubungan antara konsentrasi metilen biru dengan absorban. Persamaan garis bisa dicari setelah menggambar kurva.

Hasil Percobaan

Tabel 1 Penentuan panjang gelombang maksimum metilen biru

(nm) % Transmitan Absorban
600 0.541 0.267
610 0.948 0.023
620 0.483 0.316
630 0.457 0.340
640 0.432 0.365
650 0.396 0.402
660 0.390 0.409
670 0.433 0.364
680 0.619 0.208

Contoh perhitungan:

= 600 nm

%T = 54,1%

A = -log %T

= -log 0.541

= 0.267

Tabel 2 Penentuan kurva standar dari metilen biru

[metilen biru] (M) % Transmitan Absorban
2×10-6 0.794 0.100
4×10-6 0.577 0.239
6×10-6 0.390 0.409
8×10-6 0.277 0.558
1×10-5 0.244 0.613

Contoh perhitungan:

[metilen biru] = 1×10-5

%T = 24.4%

A = -log %T

= -log 0.244

= 0.613

y = a + bx ; y = A, x = [metilen biru]

y = -0.0197 + 67250x

r = 98,88%

Pembahasan

Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain: radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer). Spektrofotometer UV-Vis membandingkan cuplikan standar yaitu substrat gelas preparat. Hasil pengukuran dari spektrofotometer UV-Vis menunjukkan kurva hubungan transmitan dan panjang gelombang ( ) (Basset 1994).

Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan, yaitu: spektrofotometer Vis (Visible), spektrofotometer UV (Ultra Violet), spektrofotometer UV-Vis, dan Spektrofotometri IR (Infa Red).  Pada spektrofotometri Vis, yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 – 750 nm. Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Senyawa yang dapat menyerap sinar UV terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna (bening dan transparan). Spektrofotometri UV-Vis menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator dan dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Sedangkan, spektrofotmetri IR berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm. Pada spektrofotometri IR digunakan untuk analisa kualitatif, misalnya untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa.

Pada umumnya sampel yang digunakan dalam bentuk larutan yang sudah diencerkan dengan jumlah konsentrasi tertentu. Larutan dengan konsentrasi yang rendah akan lebih mudah diketahui transmitannya karena kerapatan pada molekulnya kecil sehingga kemampuan menyerap radiasi elektromagnetnya kecil dan banyak radiasi yang terbaca oleh detektor pada alat spektrofotometer. Larutan metilen biru yang digunakan pada percobaan diencerkan sebanyak 5 kali yaitu 2×10-6 M, 4×10-6 M, 6×10-6 M, 8×10-6 M, dan 1×10-5 M.

Setiap senyawa punya serapan maksimal pada panjang gelombang tertentu. Panjang gelombang ini dinamakan panjang gelombang maksimum. Pada panjang gelombang maksimum, hubungan antara absorbansi dan
konsentrasi senyawa bisa disetarakan. Panjang gelombang maksimum dicari lebih dahulu supaya lebih mudah mengatur range panjang gelombang analisanya. Apabila max tidak dicari terlebih dahulu maka akan sulit menganalisa senyawa tersebut.  Menurut literatur, panjang gelombang maksimum ( max) larutan metilen biru adalah 664 nm (Sumerta, dkk 2002). Panjang gelombang maksimum dari hasil percobaan yaitu pada 660 nm dengan konsentrasi metilen biru sebesar 6×10-6 M. Jadi, hasil yang didapat pada percobaan tidak berbeda jauh dengan literatur.

Nilai absorban dapat dihitung dari setiap nilai %T yang didapatkan. Setelah nilai absorban diketahui, maka dapat dibuat kurva standar, dengan mengalurkan nilai absorban pada sumbu y terhadap konsentrasi metilen biru pada sumbu x. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mendapatkan hubungan antara konsentrasi dengan absorban, sehingga konsentrasi larutan sampel dapat diketahui.

Grafik 1 yang menggambarkan kurva hubungan antara panjang gelombang dan absorban menunjukkan bahwa nilai panjang gelombang maksimum larutan metilen biru terletak pada 660 nm dengan nilai absorban sebesar 0.409. Dari grafik tersebut didapat persmaan garis y = -0.8047 + 1.725×10-3x. Grafik 2 menggambarkan kurva hubungan antara konsentrasi metilen biru dengan absorban. Persamaan garis yang didapat dari garis tersebut yaitu y = -0.0197 + 67250x.

Simpulan

Panjang gelombang dari larutan biru metilen yang didapat bernilai 660 nm, mendekati nilai yang terdapat di literatur, yaitu 664 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa spektrofotometer yang digunakan berjenis visible atau bekerja dengan kisaran panjang gelombang 340 nm – 1000 nm.

Daftar Pustaka

Basset J et al. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC

Cairns D. 2009. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua. Penerjemah : Puspita Rini. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari : Essentials of Pharmaceutical Chemistry Second Edition.

Day R dan Underwood A. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Penerjemah : Sopyan Iis. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Quantitative Analysis Sixth Edition.

Khopkar S. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia (UI-Press)

Sumerta I, Wijaya K, dan Tahir I. 2002. Fotodegradasi Metilen Biru Menggunakan Katalis TiO2-Montmorilonit dan Sinar UV. Makalah pada Seminar Pendidikan Kimia, Yogyakarta.

pH meter dan setrifus

Posted by SEKAR ARUMSARI on June 18, 2010 in Academic |

Pendahuluan

pH meter adalah alat untuk mengukur satu satuan ukur yang menguraikan derjat tingkat kadar keasaman dari suatu larutan. pH merupakan singkatan dari potensial hidrogen, yang biasanya didefinisikan sebagai negatif logaritma dari aktifitas ion hidrogen. Skala pH mulai dari 0 sampai 14, namun ada juga pH ekstrem mencapai 15 pada larutan dengan standardisasi tertentu. pH dibentuk dari informasi kuantitatif yang dinyatakan oleh tingkat derajat keasaman atau basa yang berkaitan dengan aktivitas ion hidrogen. Nilai pH dapat dihitung dengan cara membandingkan konsentrasi ion hidrogen [H+] dengan konsentrasi ion hidroksil [OH]. Dari hasil perhitungan, jika diperoleh [H+] lebih besar dari [OH] maka larutan tersebut merupakan larutan asam yang mempunyai pH kurang dari 7, sedangkan jika [H+] lebih kecil dari [OH] maka larutan tersebut merupakan larutan basa yang mempunyai pH lebih dari 7. Jika besar [H+] sama dengan [OH] maka larutan tersebut merupakan larutan netral yang mempunyai pH 7. Pengukuran pH biasanya dilakukan dengan kertas lakmus dengan perubahan warna yang bervariasi. Perubahan warna juga dipengaruhi oleh indikator yang ekerja pada skala pH tertentu. Pengukuran dengan kertas lakmus akan menjadi kendala jika larutan yang diujikan berwarna, karena sering terjadi kesalahan dalam pembacaan warna. pH dapat diukur secara akurat dengan menggunakan pH  meter (Oxtoby 2001). Pada pH meter, potensial elektro kimia yang terjadi antara larutan yang terdapat di dalam elektroda gelas yang telah diketahui dengan larutan yang terdapat di luar elektroda gelas yang tidak diketahui. Hal ini dikarenakan lapisan tipis dari gelembung kaca akan berinteraksi dengan ion hidrogen yang ukurannya relatif kecil dan aktif. Elektroda gelas tersebut akan mengukur potensial elektrokimia dari ion hidrogen. Untuk melengkapi sirkuit elektrik dibutuhkan suatu elektroda pembandingn dan juga perlu dilakukan kalibrasi dengan menggunakan larutan yang equivalen yang lainnya untuk menetapkan nilai pH (Achmadi 2005). Sebelum pengukuran larutan, elektroda dibilas dengan air suling dan dikeringkan dengan kertas tissue yang bersih. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan pengukuran yang akurat.

Sentrifus adalah alat yang digunakan untuk memisahkan cairan atau partikel yang memiliki berat jenis berbeda. Mesin sentrifus terdiri dari container yang berlubang-lubang untuk meletakkan tabung reaksi. Jangkauan diameter mangkuk yang berlubang dari 10 cm sampai 15 cm dengan panjang: rasio diameter 4-8. Mesin sentrifus dapat berputar dengan sangat cepat mencapai 40.000 rpm secara horizontal. Seiring dengan perputaran tabung reaksi, partikel yang lebih berat mengendap ke dasar tabung dan partikel yang lebih ringan tertinggal di atas (Prasetyo 1999).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan mengetahui prinsip penggunaan pH meter untuk mengukur derajat keasaman suatu bahan dan sentrifus untuk melakukan proses pemisahan suatu suspensi.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum pengenalan alat-alat laboratorium adalah mengenai pengukuran pH adalah pH meter, gelas ukur 25 ml, gelas piala 150 ml, dan dua buah tabung sentrifus. Sedangkan alat yang digunakan untuk melakukan sentrifugasi adalah sentrifus Beckmen JA-20, neraca timbang, tabung sentrifus, dan gelas ukur.

Bahan yang digunakan dalam penggunaan alat pH meter, yaitu: larutan fosfat 0,2 M, larutan asam sitrat 0,1 M. Suspensi kloroplas dan akuades diperlukan dalam percobaan mengenai penggunaan alat sentifus.

Prosedur Percobaan

Sebelum melakukan pengukuran dengan pH meter, siapkan 7,16 g fosfat dan 2,1 g asam sitrat. Kemudian diencerkan dengan labu takar 100 ml. pH meter digunakan untuk menghitung konsentrasi ion [H+] yang terkandung dalam campuran larutan fosfat (Na2HPO4.2H2O) 0,2 M dan asam sitrat 0,1 M dengan perbandingan volume 35ml dan 65 ml.

Pada penggunaan sentrifus, suspensi kloroplas sebanyak 50 ml dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang telah disediakan. Sebagai penyeimbangnya, cari tabung sentrifus yang beratnya sama atau perbedaannya tidak lebih dari 100 mg. Setelah itu tabung ditempatkan berlawanan pada rotor sentrifus Beckman JA-20. Dalam prosedur pengoperasiannya, rotor diputar dengan kecepatan 1200 x g selama 10 menit. Pellet yang didapat dari hasil putaran rotor ditimbang agar diketahui bobotnya.

Hasil Percobaan

Tabel 1 Bobot pelet kloroplas

Meja Tabung 1 (g) Tabung 2 (g) Rata-rata (g)
1 2,84 2,18 2,51
2 1,84 2,67 2,325
3 0,68 1,17 0,925
4 2,33 1,14 1,73

Contoh perhitungan:

Bobot kosong tabung sentrifus 1 = 15,67g

Bobot kosong tabung sentrifus 2 = 16,07g

Bobot tabung sentrifus 1 + pellet = 16,35g

Bobot tabung sentrifus 2 + pellet = 16,77g

Bobot pellet 1 = 0,68g

Bobot pellet 2 = 1,17g

Rata-rata = 0,925 g

RCF          =    1,12 x 10-5 x r

1200          =    1,12 x 10-5 x 10,8 cm

1200          =    12,096 x 10-5 x

99,2063 x 10-5 = x

RPM         =    0,0996

Tabel 2 Hasil standardisasi

pH Hasil Pengukuran
1 2
4 3,97 4,13
7 7 6,94

Contoh perhitungan:

Massa fosfat yang akan dijadikan larutan:

M =          0,2 M =  x

gram fosfat  = 7,16 gram

Massa asam sitrat yang akan dijadikan larutan:

M =          0,1 M =  x

gram asam sitrat = 2,1 gram

Tabel 3 Hasil pengukuran pH sampel

Meja pH terukur
1 3,21
2 3,89
3 3,88
4 3,03

Pembahasan

Pada prinsipnya pengukuran suatu pH adalah didasarkan pada  potensial elektro kimia yang terjadi antara larutan yang terdapat didalam elektroda gelas yang telah diketahui dengan larutan yang terdapat diluar elektroda gelas yang tidak diketahui. Hal ini dikarenakan lapisan tipis dari gelembung kaca akan berinteraksi dengan ion hidrogen yang ukurannya relatif kecil dan aktif, elektroda gelas tersebut akan mengukur potensial elektrokimia dari ion hidrogen. Untuk melengkapi sirkuit elektrik dibutuhkan suatu elektroda pembanding.

Larutan yang terbuat dari campuran penahan digunakan agar pH suatu contoh tidak berubah. Campuran penahan (buffer) adalah larutan yang dapat mempertahankan pH suatu larutan bila tertambahkan asam ataupun basa. Larutan buffer biasanya terbuat dari asam lemah dengan garamnya tau basa lemah dengan garamnya. Campuran penahan dapat mempertahankan pH suatu larutan dengan mempertahankan nisbah komponennya sehingga tidak berubah terlalu besar bila ditambahkan asam atau basa.

Dari hasil percobaan yang dilakukan, diperoleh bahwa campuran dari larutan fosfat dan asam sitrat merupakan larutan asam karena memiliki nilai pH kurang dari 7. Hal ini ditunjukkan dari pH yang terukur dari pH meter, yaitu 3,21; 3,89; 3,88; 3,03. Sebelum mengukur pH larutan, perlu dilakukan kalibrasi dengan menggunakan larutan yang equivalen lainnya untuk menetapkan nilai pH. Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan larutan yang memiliki pH 4 dan 7. Dari hasil kalibrasi diperoleh pH yang mendekati pH 4 yaitu  3,97 dan 4,13; dan yang mendekati pH 7 yaitu 7 dan 6,94.

Sentrifugasi melibatkan penerapan gaya sentrifugal untuk membawa tentang pemisahan bahan. Ini dapat diterapkan untuk pemisahan cairan bercampur dan pemisahan padatan dari cairan yang tak terpecahkan. Prinsip kerja dari semua cakram vertikal sentrifugal dan botol sentrifus didasarkan pada penggunaan kekuatan sentrifugal untuk pemisahan zat dalam campuran yang heterogen. Sentrifus yang diputar dengan kecepatan 1200 x g selama 10 menit menyebabkan terbentuknya pellet dan supernatant. Dari hasil percobaan diperoleh berat pellet yaitu sebesar 0,68 gram.   Pellet merupakan endapan yang berisi material sel dan zat pengotor, sedangkan supernatan adalah cairan yang berisi material sel yang lebih ringan sehingga tidak ikut mengendap bersama pellet.

Simpulan

pH larutan dapat diukur secara akurat dengan menggunakan pH meter. pH campuran yang terbentuk berdasarkan pada konsentrasi dan volume larutan yang dicampur. Sebelum mengukur pH campuran, kalibrasi harus dilakukan terlebih dahulu agar pH yang diperoleh konstan. Campuran antara fosfat dan asam sitrat merupakan larutan asam karena memiliki pH kurang dari 7. Sementara itu, sentrifus merupakan alat yang berfungsi untuk memisahkan organel sel dengan proses pengendapan. Proses sentrifugasi ini menghasilan pellet yang berisi material sel lain dan zat pengotor, dan supernatan yang berisi material sel yang lebih ringan.

Daftar Pustaka

Achmadi S. 2005. Kimia Dasar: Konsep-konsep Inti. Jakarta: Erlangga.

Oxtoby D. 2001. Prinsip Kimia Modern. Jakarta: Erlangga.

Prasetyo P. 1999. Bengkel Ilmu GENETIKA. Jakarta: Erlangga.

Copyright © 2010-2017 this is it All rights reserved.
This site is using the Desk Mess Mirrored theme, v2.4, from BuyNowShop.com.